박층크로마토그래피법

1. 박층 크로마토그래피의 정의 및 원리 

 

1) 정의 : 여과지에 적당한 용매를 침투시키면 여과지 위에 있는 물질은 용매의 이동과 동시에 그 물질 고유의 이동률에 따라 이동한다. 이 현상을 이용하여 혼합물을 분리하는 방법을 여과지 크로마토그래프 법이라고 하며 물질의 확인 시험 및 순도시험 등에 쓰인다. 이 방법은 여과지 크로마토그래프 법에서 여과지 대신 실리카 겔의 박층을 쓰는 방법이다. 

 

 2) TLC의 원리 

TLC법은 실리카겔, 알루미나 혹은 섬유상 물질을 얇게 입혀 건조한 유리판을 정지상으로 사용한다. 유리판을 전개판이라 부른다. 전개판은 손장갑을 낀 다음 만져야 손바닥의 땀에 포함된 오염물 (주로 아미노산)이 묻어나는 것을 방지할 수 있다. 시료 용액은 전개판에 점적한 다음 건조한다. 전개판을 적당한 용매에 담그고 밀폐한 후에 이동상 용리액을 흐르게 조작한다. 이 과정을 전개라고 한다. 전개가 완료되면 이동상의 위치를 여러 가지 방법으로 확인하여 표시하고, 주로 연필을 사용한다. TLC에서는 시료를 분리하여 머무는 위치를 머무름 계수 Rf로 나타낸다. Rf는 전개판의 연필 표시선으로부터 이동한 시료의 거리 값 dR을 이동한 용매의 거리 값 dM으로 나눈 값이다. 

Rf = dR / dM

Rf는 1~0사이의 값을 갖고 물질 고유의 값이다. 그러므로 정성 분석할 때는 시료와 표준물을 같은 전개판에 점적한다. 점적은 시료를 용매에 녹인 다음 연필로 표시한 얇은 층판의 지정된 위치에 모세관이나 마이크로 피펫으로 소량의 시료 용액을 묻힌 다음 용매를 증발 건조하는 조작을 의미한다. 시료와 표준물의 Rf값이 있으면 동일한 화합물이다. 

 

 

2. 전개방법 

TLC의 분리는 얇고 균일하고 조밀하게 유리판 위에 도포한 작은 입자에 따라 결정된다. 전개판은 실리카겔 분말이나 알루미나 분말을 물과 함께 가한 황산칼슘(10~15%)과 섞어 반죽으로 만든다. 깨끗하게 씻어 건조한 유리판 위에 적당량의 반죽을 놓고 균일하게 도포한다. 간단한 실험에는 실리카겔 G35g과 클로로폼 100㎖의 혼합용액에 현미경 슬라이드 유리를 담궈 입힌다음 건조한 후 사용한다. 이때 실리카겔의 유리부착을 증진하려고 황산칼슘을 넣는다. 최근에 정지상 두께 값이 100~2000㎛가 되는 상품도 시판이 되고 있다. 넓은 전개판은 많은 시료를 함께 전개할 수있다는 장점이 있다. 셀룰로오스로 만든 전개판의 경우는 탄수화물, 아미노산, 핵산 유도체, 무기 화학종 같은 친수성 화합물의 분리에 유용하다. 셀룰로오스 전개판은 종이 크로마토그래피 법과 비슷하다. 보통의 전개판을 사용할 때 0.01~1% 시료 용액을 0.5~5㎕정도, 그리고 고성능 전개판은 0.05~0.5㎕를 사용한다. 시료용액은 전개판의 끝에서 1~2㎝되는 위치에 연필로 선을 그어 표시한 장소에 점적한 다음 용매를 증발 건고한 후 이동상 용액에 전개판을 담근다. 시료를 점적할 때 반점의 지름은 작을수록 좋다. 이동상 용매를 넣은 적당한 그릇 혹은 비커에 전개판을 넣고 뚜껑을 닫아 이동상 용매로 그릇 안의 공기를 포화한 다음 전개한다. 뚜껑을 닫지 않으면 전개판을 따라 이동하는 이동상 용매들이 증발하므로 시료 전개에 어려움이 있다. 

TLC의 이동상은 HPLC와 같게 선택하고 정상과 역상 법으로 전개한다. 시료들이 이동상에 너무 잘 녹고 TLC판에 흡착력이 작으면 시료는 이동상의 이동속도와 거의 같은 속도로 이동하므로 분리되지 않을 것이다. 그러므로 전개할 때는 HPLC처럼 혼합 용매를 많이 사용한다. 

얇은 층 전개판 상의 이동상 용매는 전개판 끝까지 이동하기 전에 전개판을 그릇에서 꺼낸 다음 먼저 이동한 용매의 위치를 연필로 표시하고 건조한다. 첫 번째 전개에서 완전하게 시료를 분리하지 못하면 90˚로 방향을 바꾸어 같은 용매로 혹은 건조 후 다른 용매로 2,3차로 전개하여 분리할 수 있다. 분리된 시료는 표준물의 Rf값과 비교하여 확인한다. 

 

3. 분리된 시료의 확인방법

 1) 물리적 방법은 형광등을 이용하는 방법이다. 시료의 분자구조들이 이중결합 혹은 삼중결합을 가지면 형광등이 불빛을 쪼일 때 형광을 발생한다. 또 한 가지 방법은 전개판을 만들 때 정지상 지지물에 황화카드뮴 혹은 황화아연을 미리 섞어 전개판을 만든다. 이와 같은 TLC판은 F 혹은 UV라고 상품에 기재되어 있다. 이러한 전개판을 이용해 형광 분석시료를 전개하여 자외선을 쪼이면  노랑~파랑의 바탕색 위에 검은색으로 나타난다. 이러한 방법을 형광 소광 법이라 한다. 어떤 경우는 형광 유도체로 만들어 전개한 다음 형광 법으로 확인한다. 확인함과 동시에 연필로 형광의 경계를 표시한다. 

 

 2) 화학적 확인법에 이용하는 207가지의 발색 시약이 발표되어 있다. 아래의 발색 시약은 대부분 분무하거나 전개판을 담궈 발색한다. 

• 대부분의 유기화합물은 아이오딘과 반응하여 갈색을 띠므로 전개판을 건조 후 아이오딘이 들어 있는 밀폐그릇에 전개판을 넣어 두면 갈색 반점이 나타난다. 꺼낸 다음 즉시 연필로 표시한다. (아이오딘이 증발하면 갈색이 없어지기 때문) 건조한 전개판 위에 1% 아이오딘 용액을 분무기로 분무하여 발색할 수도 있다.
• 진한 황산, 질산을 섞은 황산, 다이크로뮴산소듐 또는 무수 아세트산을 전개판에 분무하고, 유기화합물의 탄소와 반응시켜 황갈색이나 흑색으로 변하는 반점을 확인하는 방법도 있다. 
• 산-염기 화합물은 지시약을 분무하여 확인한다.
• 알코올계는 세륨, 알데하이드계와 키톤계는 2,4-dinitrophenylhydrazine, barbituate계 화합물은 다이 에틸아민을 사용한다. 
• Flavonoid, indole, 스테로이드계는 𝑝-톨루엔을 사용한다.

 

 

4. 정성적 확인방법 및 정량적 확인방법

• 정성적 확인방법 : 표준물의 Rf값과 비교하여 확인한다. Rf값은 정지상의 두께, 이동상의 수분함량, 온도, 전개실의 이동상 증기 포화도, 시료량에 따라 변할 수 있다. 그러므로 표준물은 항상 분석시료와 함께 동일한 전개판 위에서 전개하여야 한다. 전개된 분석시료는 반점 부위의 정지상을 긁어낸 다음 용매로 녹여 질량 분광법, NMR, IR 분광법 등으로 다시 확인할 수 있다. 이와 같은 방법은 정지상을 두껍게 만들고 시료를 많이 사용하여 전개하는 것이 편리하다.
• 정량적 확인방법 : 첫째, 정지상을 긁어낸 다음 추출하여 정량하는 방법. 둘 째, 분리된 반점의 넓이를 측정하여 비교하는 방법인데 이 방법은 20~50%의 상대 불확실성을 갖는다. 셋 째는 densitometer를 이용하여 전개판의 반점 위치에서 투광도를 측정하는 두 가지 방법이 있다. 그중 한 가지는 가시광의 텅스텐 광원을 이용하고 다른 한 가지는 수은 등을 사용한 형광 측정방법이다. 이 방법은 1~5%의 정밀도를 갖는 정확한 방법이다.