액체 크로마토그래피법

1. 액체 크로마토그래피 법이란?

액체 크로마토그래피 법은 액체 상태의 시료를 분리, 정량하는 방법이다. 용매에 녹지 않는 물질은 액체 크로마토그래피 법으로 분리할 수 없다. 크로마토그래피 법은 정지상의 형태에 따라 평면형과 분리 관형으로 분리가 된다. 그리고 이동상의 종류에 따라 기체의 경우는 기체 크로마토그래피 법, 이동상이 액체인 경우는 액체 크로마토그래피 법으로 분류된다.
감도는 GC보다 높지는 않지만 분광 광도법이나 전기화학적 분석법보다 높고 가열할 때 쉽게 분해되거나 비휘발성 물질의 분리에 우수한 방법이다. 공업 분야와 공중위생 분야에 많이 이용되고 있고, 아미노산, 단백질, 헥산, 탄수화물, 약품, 살충제, 항생제, 스테로이드, 금속-유기물 등의 분석에 널리 이용되고 있다.

2. 액체 크로마토그래피법의 분류

아래 4가지 종류의 액체 크로마토그래피법은 시료의 종류에 따라 각기 다른 용도로 이용한다.

1) 분배 크로마토그래피법 : 정지상의 종류에 따라 다음과 같이 분류된다. 극성이 작고 이온이 아닌 중성 분자 화학종은 이 방법으로 분리하고 주로 동족 계열 화합물의 분리에 많이 이용한다.

• 액체-액체 크로마토그래피법 : 정지상 충진 입자의 표면에 시료를 물리적으로 흡착한다. 사용 중에 정지상이 이동상에 녹아 나가는 단점 때문에 점차로 사용하고 있지 않다.
• 결합상 크로마토그래피 : 정지상은 충진 입자의 표면에 화학적으로 결합되어 있다. 액체-액체 크로마토그래피 법보다 더 우수한 방법이다.

2) 흡착 혹은 액체-고체 크로마토그래피법 : 정지상은 실리카와 알루미나를 주로 사용한다. 비극성 화합물, 구조 이성질체, 지방족 알코올 등의 분리에 이용한다.

3) 이온 크로마토그래피법 : 이온교환수지를 정지상으로 사용하여 이온 화합물을 분리한다. 분자량이 작은 이온 화합물일 경우 이 방법을 선택한다.

4) 크기-배체 혹은 젤 크로마토그래피 법 : 일정한 구멍 크기를 갖는 입자를 정지상으로 이용한다. 시료의 분자량이 10,000 이상 되는 화합물일 경우 이 방법을 선택하고, 이 방법은 분자 크기에 따른 분리관의 통과속도 차이를 이용하는 방법이다.

3. 정지상에 의한 분류

1) 역상 크로마토그래피법

• 소수성 정지상과 친수성 이동상을 사용한다.
• 이와 같은 역상 크로마토그래피 법에서 이동상은 물과 에탄올, 메탄올 혹은 아세토 나이트릴을 섞은 혼합 용매를 일반적으로 사용하므로 용매의 극성이 더 커진다.
• 작은 극성 혹은 비극성을 띠는 정지상으로부터 극성 화합물이 이동하면서 분리된다.
• 정지상은 실리카 표면에 octyl 혹은 octadecyl 작용기를 결합시켜 소수성 정지상으로 사용한다.
• 종이 크로마토그래피 법 (PC)이나 얇은 층 크로마토 그래피 법 (TLC)에서도 이 방법을 이용한다.
• 분석시료에 따라 분류하면 비극성 시료는 역상 충진물, 극성 시료는 정상 충진물, 이동상 시료는 이온 교환 충진물을 이용하여 분리한다.

2) 정상 크로마 토그래피법

• 친수성 정지상과 소수성 이동상을 이용한다.
• 정상 크로마토그래피 법에서 이동상은 에틸에 터, 클로로포름, n-헥산 같은 용매를 이용한다.

4. 이동상의 조건

1) 용매는 분석 용질을 녹일 수 있어야 한다.
2) 시료의 봉우리와 이동상의 봉우리는 겹치지 않아야 한다.
3) 용매 가격은 저렴할수록 좋다.
4) 분리관의 사용 온도보다 20~50℃ 높은 끓는점의 용매를 사용한다.
5) 용매의 점도는 낮을수록 좋다.
6) 용매는 용질 혹은 충진제와 화학반응하지 않아야 한다. 그러므로 알데하이드, 올레 픽, 황화합물 키톤 혹은 어떤 질소화합물들은 용매로 사용하기에 부적당하다.
7) 용매는 정지상을 용해하지 않아야 한다.
8) 굴절률 검출기를 사용할 때 이동상과 분석시료의 굴절률 차이는 커야 한다.
9) 용매는 발화성과 독성이 없어야 한다.

5. 분리관 (칼럼)

충진제를 채운 분리관은 유리관의 경우 600 psi이하에서만 사용하므로 큰 압력이 필요한 HPLC의 경우는 대부분 스테인리스 스틸관을 사용한다. 분리관은 5~10㎛의 충진제를 채운 선형 10~30㎝관을 사용한다. 관의 안 지름은 4~10㎜이고, 이론 단수는 40,000~60,000단/m이다. 최근에는 안 지름 1~5㎜에 3~5㎛ 충진제를 채운 3~7.5㎝ 분리관을 이용하여 비싼 용매를 절약할 수 있고, 분리효율도 증가하는 분리관을 이용할 수 있다. 휘발성분을 포함한 복잡한 시료 물질은 5m 모세관을 이용하는 경우도 있다.
분리관에 채우는 충진제는 다공성과 표피형이 있다. 다공성 입자는 유기성 화합물이나 규조토 혹은 활성탄 입자에 정지상을 흡착시켜 사용한다. 표피형은 유리, 유기물, 폴리머, 실리카, 알루미나, 이온교환수지 등의 입자 표면에 다공성 물질층을 생성한 다음 액체 정지상을 흡착 또는 화학 결합한다.

6. 검출기

LC의 검출기는 GC의 FID, ECD, TCD처럼 예민한 것은 없다. LC에 이용하는 검출기는 첫째, 이동상의 농도 변화에 감응하는 검출기. 둘째, 용질의 어떤 성질에만 감응하는 검출기. 셋째, 이동상을 제거하고 남은 용질에 감응하는 검출기의 세 가지 종류들이 있다. 검출기는 전기화학적 검출기, 형광 검출기, 질량 분석 검출기, 자외선 검출기, 전도도 검출기, 굴절률 검출기, 적외선 검출기와 같은 종류를 사용한다. 그중에서도 질량분석 검출기와 굴절률 검출기는 모든 성분에 감응하지만 나머지는 선택적으로 감응한다. 검출기 중에서 가장 많이 사용하는 순서는 UV검출기 > 형광 검출기 > 굴절률 검출기 > 전기화학 검출기이다. 자외선 검출기는 중수소 등보다 수은등 광원을 더 많이 사용하고 있다.